L’essor de l’ADN environnemental dans le biomonitoring : contexte et enjeux

Alors qu’elles abritent près de 30 % des espèces de vertébrés (WWF, 2020), les eaux douces subissent une perte de biodiversité deux à trois fois supérieure à celle des habitats terrestres et marins (Albert et al., 2021), avec environ un quart des espèces (connues) d’eau douce aujourd’hui menacées d’extinction (Sayer et al., 2025). Les pressions subies par ces écosystèmes sont multiformes, cumulatives et spatialement hétérogènes (Dudgeon, 2019), ce qui représente un défi majeur pour les méthodes de biosurveillance traditionnelles. Ces méthodes impliquent souvent un échantillonnage invasif (induisant la mortalité des organismes échantillonnés dans certains cas), elles sont chronophages et présentent donc des limites pour les études à grande échelle. Aussi, dans ce contexte, les besoins d’évolution des surveillances écologiques sont forts. Il s’agit notamment d’intégrer des approches à haut débit et non invasives telles que les méthodes basées sur l’analyse de l’ADN environnemental (ADNe). Même si des challenges existent encore (i.e., standardisation des méthodes, normes de qualité communes, enrichissement des bases de référence…) pour aboutir à une intégration de ces méthodes dans les cadres réglementaires de surveillance (Altermatt et al., 2025), l’utilisation de l’ADNe révolutionne déjà nos capacités de caractérisation et de surveillance de la biodiversité aquatique.

L’ADNe est défini comme l’ADN extrait à partir d’un échantillon environnemental sans isoler au préalable aucun organisme cible (Taberlet et al., 2012). L’échantillon peut être de l’eau, du sol, des sédiments, de l’air, des fèces ou contenus intestinaux ou même des sources anciennes comme des carottes de glace, sédiments ou pergélisol (Thomsen et Willerslev, 2015). En ce qui concerne les macroorganismes, cet ADN retrouvé provient de la libération de matériel génétique dans l’environnement, par exemple par la desquamation des cellules de la peau ou d’écailles, l’excrétion de fluides corporels, la défécation ou encore la libération de gamètes (Pawlowski et al., 2020) ; alors que pour les microorganismes, la cellule elle-même (donc l’organisme cible) et l’ensemble de son génome est prélevé. L’ADNe désigne donc l’ensemble de l’ADN isolé à partir d’échantillons environnementaux incluant l’ADN extra-organismes et l’ADN intra-organismes pour les microbes (Rodriguez-Ezpeleta et al., 2021) (figure 1).

Depuis les premières applications pour la détection d’amphibiens (Ficetola et al., 2008), l’utilisation de l’ADNe a été exponentielle, et le groupe des poissons est celui qui a le plus fréquemment été étudié dans le cadre de ces développements (~ 50 % des études), surtout en milieu d’eau douce (Takahashi et al., 2023).

Une part significative de l’effort global de recherche sur l’ADNe a donc été appliquée aux problématiques piscicoles en lacs, avec des travaux posant les bases des comparaisons entre relevés traditionnels et ADNe à l’échelle des communautés piscicoles (Hänfling et al., 2016b). Par ailleurs, différentes matrices environnementales ont été explorées, comme les sédiments pour reconstituer la dynamique long-terme des poissons via les archives sédimentaires lacustres (Lopez et al., 2024), mais aussi les biofilms retrouvés en zone littorale des lacs (Gauvin et al., 2025) permettant de détecter des signaux ADN des macro-organismes aquatiques. Néanmoins, l’eau est la matrice pour laquelle les études sont le plus étayées à ce jour en ce qui concerne la production d’inventaire piscicole (Rourke et al., 2022).

Le fort accroissement des applications ADNe sur la matrice « eau » s’accompagne aujourd’hui d’une diversification considérable des protocoles utilisés, ceci alors même que les méthodologies standardisées constituent un pré-requis pour le transfert opérationnel et la mise en oeuvre effective par les futurs opérateurs de terrain et les décideurs.

Outre les besoins d’homogénéiser et standardiser les différentes étapes des procédures ADNe, des optimisations et démonstrations sont encore attendues sur le volet quantitatif des détections et inventaires produits. En effet, à ce jour, l’ADNe est encore souvent considéré comme ne pouvant pas remplacer totalement les méthodes traditionnelles lorsqu’il s’agit d’estimer les abondances des espèces, ceci en raison notamment des facteurs impliqués dans le devenir de l’ADNe relargué dans l’eau qui complexifient l’interprétation quantitative.

La dynamique de la production, distribution spatio-temporelle, persistance et dégradation de l’ADNe dans le milieu est un sujet sur lequel les recherches se sont concentrées ces dernières années (Harrisson et al., 2019 ; Jo et al., 2020). Divers facteurs environnementaux, tels que la température, le pH, le rayonnement ultraviolet ou l’oxygénation de l’eau peuvent affecter l’état de l’ADNe relargué dans l’environnement, avec des risques de dégradation en quelques jours rendant le signal indétectable (Barnes et al., 2014 ; Seymour et al., 2018) ou au contraire la capacité de persister jusqu’à des centaines voire des milliers d’années dans un état analysable dans les sédiments lacustres (Domaizon et al., 2017).

De même, des questions de représentativité spatiale du signal ADNe peuvent se poser, plus particulièrement dans les systèmes lotiques ou l’ADNe peut être transporté en aval jusqu’à des dizaines de kilomètres (Deiner et Altermatt, 2014). En lac, le signal est en général moins soumis à cette problématique même si elle est aussi prise en considération (Harper et al., 2019).

Des facteurs biotiques sont également en jeu pour expliquer notamment le taux d’émission de l’ADNe dans l’environnement ; l’émission peut par exemple être influencée par l’âge et les stades de vie des organismes chez les poissons (Takeuchi et al., 2019), ou leur activité et métabolisme (Stewart, 2019). La phénologie, les déplacements pour l’utilisation des habitats varient au cours de l’année (zone refuge pour les juvéniles de poissons, lieux de nutrition…) et ainsi induisent une répartition spatiale variable de l’ADNe dans le milieu d’étude (Ghosal et al., 2018). Les périodes de reproduction en particulier sont a priori des périodes de fort relargage d’ADNe (Di Muri et al., 2023).

Diverses études ont posé des bases pour aller vers des données plus quantitatives reflétant les abondances et biomasses des espèces présentes au sein d’assemblages biologiques naturels. À ce jour, il est largement admis que la quantification de l’ADNe dans une masse d’eau peut fournir des indications sur l’abondance des espèces (Rourke et al., 2022) et même sur leur phénologie (Bylemans et al., 2018).

Les corrélations entre concentration en ADNe et abondancebiomasse des espèces sont en effet avérées, au moins sur des échelles spatio-temporelles définies, comme le rapporte la synthèse de Rourke et al. (2022) basée sur soixante-trois études publiées. Si le nombre de copies d’ADN (par litre d’eau) pour une espèce est un indice suffisamment pertinent pour refléter l’abondance et/ou biomasse de cette espèce, les outils de quantification n’étaient jusqu’à récemment pas toujours suffisamment sensibles (ex. : PCR quantitative). La possibilité aujourd’hui de mobiliser des outils tels que la PCR digitale qui permet des quantifications absolues, très sensibles et robustes pour des estimations quantitatives consolide les possibilités d’applications (Capo et al., 2021). Toutefois ces méthodes ciblées se limitent encore à la quantification au mieux de quelques espèces simultanément (par multiplexage). En parallèle, des tentatives ont été faites pour obtenir des données à valeurs quantitatives pour des communautés piscicoles entières (Pont et al., 2023 ; Ushio et al., 2018) ; ces approches permettent de transformer les nombres de « reads » ADN (issus du métabarcoding) en nombre de copies ADN de chaque espèce inventoriée (avec une meilleure approximation de l’abondance-biomasse de l’espèce dans l’échantillon initial) (figure 2). Toutefois des comparaisons et validations formelles de ces approches font encore défaut, et en l’absence de relation universelle entre concentration d’ADNe et biomasse/densité de l’espèce, la consolidation de la valeur quantitative des données ADNe doit être poursuivie.

Les pistes pour améliorer la quantification s’appuient sur des méthodes telles que la dPCR (PCR digitale), qui peuvent être utilisées seules ou combinées avec le métabarcoding, mais aussi sur l’utilisation de standards internes et contrôles quantitatifs qui peuvent être ajoutés à différentes étapes du processus de métabarcoding, ainsi que la combinaison de méthodes de suivi (ex. : ADNe et méthodes d’observation par ROV (véhicule sub-aquatique téléopéré, en anglais : remotely operated underwater vehicle), caméras et autres méthodes acoustiques). Les travaux présentés ici s’inscrivent dans ce contexte et visent non seulement à standardiser et démontrer l’opérationnalité des protocoles pour les inventaires de communautés piscicoles ou la détection d’espèces ciblées, mais aussi à optimiser les informations quantitatives pour ces méthodes ADNe.

Des approches ciblées et quantitatives pour l’étude de la phénologie de reproduction des poissons

Comprendre les variations phénologiques des processus démographiques est essentiel à la gestion des populations de poissons. Il s’agit notamment de connaître l’utilisation saisonnière de l’habitat, la localisation des frayères et la période précise de la reproduction afin d’adapter la gestion et la préservation des habitats indispensables au maintien de la dynamique des populations piscicoles.

Pour suivre l’activité de frai des poissons, les méthodes sont généralement invasives (ex. : pêche au filet maillant, collecte d’œufs fécondés) ou traumatisantes (ex. : pêche électrique ou télémétrie acoustique), et les méthodes non invasives telles que les inventaires visuels ou acoustiques sont souvent sensibles aux biais des observateurs ou erreurs d’identification taxonomique. Des applications récentes ont démontré le potentiel de l’ADNe pour suivre les périodes de frai des poissons (Bylemans et al., 2017), offrant ainsi une approche alternative si les protocoles appliqués fournissent une information quantitative suffisamment robuste pour détecter les début, fin et pics d’activité de reproduction. Une corrélation entre la concentration d’ADNe de poisson dans l’eau et son activité de frai a été démontrée dans les rivières pour les espèces de poissons diadromes et potamodromes¹ (Bracken et al., 2019 ; Thalinger et al., 2021). Pour les espèces de poissons non migrateurs, des approches basées sur l’ADNe ont été initialement utilisées dans les rivières, par exemple pour l’étude de l’activité de frai de la perche australienne Macquarie (Macquaria australasica) (Bylemans et al., 2017). Bien que certaines corrélations aient été établies entre le signal de l’ADNe dans l’eau et l’abondance des poissons dans les lacs (Nevers et al., 2018), une seule approche de « metabarcoding » de l’ADNe a été réalisée pour surveiller les périodes de frai de l’omble chevalier (Salvelinus alpinus L.) dans les lacs (Di Muri et al., 2023). À ce stade, les mises en application des méthodes ADNe pour la surveillance des phénologies sont encore très rares et des démonstrations sont encore nécessaires. Dans le cadre du projet Quanti-Fish, des protocoles ont été consolidés et des déploiements in situ ont été réalisés sur le Léman (lac franco-suisse).

Démonstration de l’opérationnalité de nouveaux protocoles quantitatifs (dPCR) ciblés pour quelques espèces clés

En s’appuyant sur les résultats d’études démontrant une augmentation des concentrations d’ADN pendant la saison du frai (Lacoursière-Roussel et al., 2016), nous avons, à l’aide d’une méthode ADNe quantitative (utilisant la digital PCR), et en proposant de nouvelles amorces moléculaires quand nécessaire, testé la robustesse de ces méthodes non invasives pour suivre le déroulement des périodes de reproduction de plusieurs espèces de poissons en lacs. Les espèces illustrées ici sont la perche, le corégone et le brochet. Ces trois espèces ont toutes un intérêt économique et écologique, mais elles possèdent également des caractéristiques de reproduction différentes (ex. : période de reproduction hivernale ou printanière, migration ou pas des adultes dans le lac au cours de l’activité de frai). Les données obtenues par l’ADNe ont été confrontées à celles issues de méthodes traditionnelles (pêche au filet, collecte d’œufs fécondés ou comptages visuels).

Les protocoles détaillés utilisés pour ces démonstrations sont publiés (Vautier et al., 2023 ; Vautier et al., 2026), seuls les résultats principaux sont présentés ici.

D’une part, les travaux ont permis la validation des protocoles ADNe, incluant tests de spécificité, et tests de sensibilité pour les nouveaux marqueurs proposés.

Pour s’assurer que les fluctuations du signal ADNe observées lors des suivis de la phénologie de la reproduction ne sont pas le reflet de changements affectant l’ensemble du signal ADNe poisson (par exemple, effet de phénomènes hydrodynamiques induisant le déplacement de tous les signaux ADNe) mais sont bien spécifiques à la reproduction, nous avons choisis, et recommandons, de quantifier simultanément (dans le même extrait d’ADNe) le signal ADNe d’une espèce en cours de reproduction et celui d’une espèce qui ne se reproduit pas à la même période (appelée ci-après « espèce contrôle »). Pour les suivis réalisés sur les trois espèces, on observe que le signal ADNe de l’espèce contrôle reste systématiquement à un niveau faible, basal, avec peu ou pas de fluctuations dans le temps, tandis que pour les espèces se reproduisant une dynamique marquée, avec un pic unique s’étalant sur les semaines de reproduction, est bien visible (figure 3).

Par ailleurs, ces travaux ont permis de réaliser une mise en application in situ pour le suivi des espèces sélectionnées afin de démontrer l’applicabilité et la robustesse des protocole.

Application pour une espèce à reproduction hivernale : le Corégone

Le corégone, poisson emblématique du Léman, se reproduit en hiver en zone littorale. Sa reproduction a été suivie entre 2018 et 2021 à la fois par utilisation de filets maillants, de comptages visuels et par l’analyse de l’ADNe (échantillonnage fait en amont de la pêche). Pour les trois hivers étudiés, l’ADNe du corégone a été détecté à chaque date d’échantillonnage. Les deux méthodes ont permis d’identifier une période de reproduction débutant début décembre et se terminant mi/fin janvier (durée six à huit semaines), avec un pic majeur unique situé entre mi-décembre et début janvier selon les années. Une bonne concordance est observée entre l’ADNe et les méthodes traditionnelles avec des pics concomitants (figure 3, illustration pour les hivers 2020 et 2021) (Vautier et al., 2023). Cette méthode ADNe est aujourd’hui intégrée dans la surveillance de routine de la phénologie de la reproduction du corégone sur le Léman (rapport de suivi CIPEL²).

Application pour deux espèces à reproduction printannière : Perche et Brochet

L’ADNe permet de détecter la perche à toutes les dates d’échantillonnage, sur les deux années de suivi (2019 et 2021). La dynamique temporelle du signal ADNe est similaire à celle obtenue par la collecte de rubans d’œufs (méthode traditionnellement utilisée pour suivre la phénologie, en utilisant des frayères artificielles). Les deux méthodes indiquent une période de frai d’environ huit semaines, avec un pic entre début et mi-mai, montrant que l’ADNe reflète bien l’activité de reproduction et pas seulement la présence des individus.

De même pour le brochet, les suivis ADNe et les comptages visuels montrent des dynamiques concordantes sur les deux années étudiées (2021-2022). Le signal augmente dès fin mars, atteint un pic mi–fin avril, puis décroît début mai. Les résultats ont confirmé que l’ADNe est pertinent pour estimer les dates clés de reproduction du brochet.

Réinterroger le choix des gènes marqueurs pour optimiser la détection des signaux de reproduction

Le génome mitochondrial (sous unité ribosomique 12 s) est généralement ciblé lors des études ADNe concernant les poissons (Miya et al., 2015 ; Valentini et al., 2016), car il y a de nombreux génomes mitochondriaux par cellule, et par conséquent potentiellement un signal plus important dans l’environnement. Cibler le génome mitochondrial a cependant un inconvénient majeur lors des suivis de la reproduction puisqu’il est quasiment absent des spermatozoïdes. En effet, les spermatozoïdes sont très différents des cellules somatiques car ils contiennent un ADN nucléaire (ADNnu) hautement condensé et protégé, alors que le nombre de génomes mitochondriaux est relativement faible. Il a été montré que pendant la période de reproduction, le signal provenant de l’ADNnu augmentait de façon plus importante que celui ciblant l’ADN mitochondrial en rivières (Bylemans et al., 2017) tandis qu’en dehors de la période de reproduction les signaux sont similaires.

Les spermatozoïdes (mobiles, abondants) étant une source majeure d’ADNe pendant le frai, nous avons donc ici comparer les signaux ADNe mitochondriaux et nucléaires lors de la reproduction de différentes espèces afin de déterminer laquelle des deux cibles – nucléaire ou mitochondriale – était la plus efficace dans ce contexte lacustre.

Les résultats illustrés ici pour le corégone (suivi de reproduction hiver 2021-2022 ; figure 4) sont sans équivoque et démontrent que l’ADN nucléaire permet de capter un signal très largement supérieur quantitativement tout en retraçant les mêmes dynamiques (moment de début, de pic, et de fin de reproduction). L’ADNnu permet donc de travailler plus confortablement avec des concentrations d’ADN moins sujettes aux problèmes de seuils de quantification des signaux rares.

Quelle plus-value de l’ARN environnemental pour le suivi de phénologie de reproduction des poissons ?

L’analyse de l’ADNe dans les écosystèmes aquatiques s’est généralisée, mais l’étude de l’ARN environnemental (ARNe) n’en est qu’à ses débuts (Cristescu, 2019). L’ARN, une molécule moins stable que l’ADN, est donc considéré a priori moins adaptée pour la surveillance environnementale. Cependant, des expériences de laboratoire récentes ont démontré que l’ARNe peut être facilement extrait et détecté dans des échantillons d’eau jusqu’à 13-72 heures après sa libération (Zou et al., 2025), les concentrations d’ARNe pouvant même être plus élevées que les marqueurs correspondants de l’ADNe (Marshall et al., 2021) en particulier lors d’échantillonnages faits à proximité des organismes étudiés (Von Ammon et al., 2019). L’ARNe a donc récemment suscité un regain d’intérêt dans la surveillance des macro-organismes : alors que les organismes morts libèrent souvent de grandes quantités d’ADN, l’ARN est produit principalement par des organismes physiologiquement actifs et donc refléteraient les assemblages d’organismes métaboliquement actifs (Cristescu 2019 ; Miyata et al., 2021) en dimunuant ainsi les taux de faux positifs qui peuvent survenir avec les méthodes ADNe.

Toutefois, pour se projeter dans des applications futures basées sur l’analyse de l’ARNe (qui par ailleurs pose des contraintes méthodologiques plus fortes que l’ADNe), des études doivent encore être menées pour démontrer la plus-value pour les questions écologiques visées.

Dans le cadre du projet Quanti-Fish, nous avons exploré l’hypothèse que l’ARNe présentant a priori une meilleure corrélation avec l’abondance des poissons (Miyata et al., 2021), pourrait permettre une meilleure estimation du nombre de poissons qui fraient, et donc représenter plus fidèlement l’activité de reproduction que l’ADNe. Pour tester cette hypothèse, nous avons réalisé un suivi ADNe et ARNe à partir d’eau prélevée directement dans le cône de détection d’une caméra acoustique installée pour suivre la reproduction du corégone dans le Léman. Les suivis ADNe et ARNe ont été réalisés toutes les quatre heures sur des périodes de vingt-quatre heures afin d’étudier la dynamique de ces deux signaux lorsque les individus sont sur site (la nuit), et lorsqu’ils n’y sont plus (le jour). À la fois les marqueurs nucléaires et mitochondriaux ont été quantifiés par dPCR.

Trois cycles nycthéméraux de vingt-quatre heures ont été réalisés, un au début de la période de reproduction (15 et 21 décembre 2021), un pendant le pic d’activité de la période de reproduction (21 décembre 2021), et un après la période de reproduction (13 janvier 2022).

Les résultats obtenus pour cette comparaison ADNe et ARNe montrent :

(i) des intensités de signaux ADNe et ARNe contrastés en faveur de l’ADNe. Le signal ARNe nucléaire est bien plus faible que le signal ADNe nucléaire, (facteur de 14 pour le marqueur nucléaire, facteur de 2 pour le marqueur mitochondrial) (figure 5).

L’hypothèse selon laquelle le signal ARNe libéré par les organismes dans l’eau est plus intense que le signal ADNe quand on se situe proche du moment de la libération du signal ne semble donc pas se vérifier lors de ce suivi, pour les deux gènes ciblés dans cette étude ;

(ii) une persistance du signal ADNe et ARNe différente mais toutes les deux cohérentes avec les observations en caméra acoustique. Les résultats montrent que contrairement à l’ADNe qui peut persister plusieurs heures après le départ des poissons, l’ARNe détecte plutôt leur présence immédiate, évitant ainsi les « faux positifs » liés à des individus déjà partis. Par ailleurs pour chacune des trois campagnes, l’ARNe reflète plus fidèlement le nombre réel d’individus (estimé par caméra acoustique) que l’ADNe. Les corrélations avec la caméra sont fortes pour l’ARNe (0,61 à 0,95) et bien que significatives sont plus faibles pour l’ADNe (de 0,25 à 0,39).

Ces corrélations varient selon les périodes : lors du pic de reproduction (21 décembre), toutes les méthodes sont parfaitement concordantes, illustrant une activité faible en journée et une augmentation du signal à partir de 19 h (figure 5). Lors des périodes à plus faible activité de reproduction (15 décembre, 13 janvier), en présence de quantité d’ARNe et ADNe plus faibles, les corrélations sont moins solides ; on note toutefois que les passages nocturnes détectés à la caméra sont reflétés dans les quantités d’ARNe et ADNe même pour des passages ponctuels d’un faible nombre d’individus (ex. : deux passages le 13 janvier) montrant la fiabilité de ces détections quantitatives.

Si l’on considère les corrélations pour toutes les données collectées (trois suivis), on constate que les approches ADNe et ARNe, ciblant le génome mitochondrial ou nucléaire, sont toutes efficaces pour décrire la présence d’individus sur un site donné et à des pas de temps de quatre heures, avec des atouts différents (tableau 1). Même si l’ARNe est plus performant pour refléter le nombre d’individus sur site, l’ADNe présente l’avantage de pouvoir être échantillonné de manière légèrement décalée (en journée) par rapport à la présence nocturne des poissons. Les résultats acquis ont également mis en évidence la nécessité de prélever à heures fixes lors de ces suivis, en cohérence avec des conclusions également obtenues en zone côtière d’un milieu marin par Jensen et al. (2022).

L’ADNe nucléaire permet de mesurer un signal très fort par rapport aux autres méthodes, mais ce signal peut parfois perdurer dans le temps et donc refléter moins fidèlement la présence immédiate des individus sur site. Il serait donc à privilégier pour cibler des espèces peu abondantes, et/ou lorsque les sites de reproduction sont incertains.

L’ARNe nucléaire bien corrélé à la présence des individus sur site, est un bon compromis entre intensité du signal et précision spatio-temporelle, et pourrait donc être utilisé pour suivre la dynamique de reproduction à des pas de temps courts y compris pour des espèces peu abondantes. Toutefois, les approches ARNe impliquent des contraintes notamment au niveau de la préservation des échantillons (filtration immédiate après prélèvement des échantillons, et préservation des filtres dans de l’azote liquide, à – 80 °C ou à l’aide de tampon commerciaux onéreux). Au regard des résultats obtenus, la plus-value apportée par les approches ARNe semble limitée dans le cadre d’un simple suivi de la reproduction, mais de nombreuses autres perspectives d’applications sont envisageables pour étudier des phénomènes comme l’éclosion, la maturation des gamètes ou encore le stress (Tsuri et al., 2021).

L’approche d’inventaire par métabarcoding des communautés piscicoles

Un projet dédié aux questions d’échantillonnage de terrain : où, quand, comment échantillonner ?

Si l’optimisation des procédures de laboratoire (i.e., extraction d’ADNe, choix des barcodes, protocoles d’amplification et méthodes de séquençage) est essentielle pour garantir une efficacité maximale du métabarcoding (Takahashi et al., 2023), le protocole d’échantillonnage sur le terrain est un aspect fondamental des approches ADNe comme il l’est pour toute étude écologique (Hänfling et al., 2016a ; Sellers et al., 2024). Concernant le métabarcoding appliqué aux communautés piscicoles, différentes stratégies d’échantillonnages ont été mises en place selon les études recensées dans la littérature, avec des différences sur la localisation du prélèvement d’eau (en berge, en zone profonde) (Hänfling et al., 2016b ; Lawson Handley et al., 2019), la profondeur du prélèvement (en surface, dans la colonne d’eau) (Littlefair et al., 2021), le type de prélèvement (ponctuel/discret ou intégré) (Civade et al., 2016  ; Rund et al., 2025 ; Vautier et al. 2026), la gestion des échantillons (isolés ou regroupés) (Sato et al., 2017), la quantité d’eau prélevée (de quelques mL à des dizaines de litres) et la temporalité de l’échantillonnage (saison) (Lawson Handley et al., 2019). Bien qu’aucune méthode ne fasse définitivement consensus, il a été établi que l’échantillonnage de la zone littorale (berges) doit être privilégié pour détecter un maximum d’espèces à partir d’un prélèvement de surface (Zhang et al., 2020), tout comme l’utilisation de cartouche de filtration fermée pour limiter les contaminations. L’échantillonnage discret, par point, est largement répandu, sans que le type d’échantillonnage (systématique, stratifié, aléatoire), la quantité d’eau prélevée ou le nombre de points ne soient standardisés. Cette technique a pour avantages de renvoyer une information localisée de la détection des espèces et sa facilité de déploiement sur le terrain. De par la distribution en patch de l’ADNe dans l’environnement lentique (Takahara et al., 2012 ; Eichmiller et al., 2014 ; Ghosal et al., 2018 ; Pukk et al., 2021), elle nécessite toutefois un nombre de points d’échantillonnage adapté, potentiellement élevé pour les grands lacs, ceci notamment pour la détection des espèces rares (Sellers et al., 2024).

Dans le cadre du projet readFish illustré ici, c’est une méthode dite « intégratrice » qui a été retenue. Elle consiste à collecter un grand volume d’eau en surface et en continu le long d’un linéaire littoral (Civade et al., 2016 ; Hervé et al., 2022). L’objectif est que l’échantillon obtenu soit représentatif de l’ensemble des habitats rencontrés et que la détection des espèces soit moins impactée par la distribution non homogène de l’ADN dans le milieu. Comme pour toute méthode d’échantillonnage il a été nécessaire de s’intéresser à la dimension spatiale (où échantillonner) et temporelle (quand échantillonner) (Hervé et al., 2022) de l’échantillonnage ainsi qu’à l’effort (le nombre de linéaires) nécessaire pour détecter un maximum d’espèces (Hervé 2023).

Les résultats du projet readFish illustrent les atouts du métabarcoding pour le suivi des communautés piscicoles lacustres. Globalement plus d’espèces sont détectées avec l’ADNe qu’avec la méthode traditionnelle utilisée pour la surveillance (filets benthiques et pélagiques), sans que ces détections ne soient de faux positifs pour autant (figure 6). Les espèces détectées seulement par l’ADNe peuvent être soit des espèces présentes en faible nombre dans les lacs, soit des espèces avec des tailles ou des écologies particulières (ex. : espèces benthiques comme la blennie, Salaria fluviatilis, ou de grande taille comme le silure, Silurus glanis). Ces dernières sont peu ou pas capturées par les filets maillants. Il arrive aussi que de rares espèces capturées par la méthode traditionnelle ne soit pas détectées par ADNe, comme la brème bordelière (Blicca bjoerkna). Il peut s’agir d’une difficulté d’assignation taxonomique avec le barcode utilisé ici (barcode « teleo ») qui peut regrouper les deux brèmes (avec la brème commune, Abramis brama) au sein d’un même « complexe » sans toujours pouvoir les différencier (Pont et al., 2018).

Conformément à ce qui a pu être observé dans d’autres études, c’est en berge que l’on détecte le plus grand nombre d’espèces (figure 7). Les linéaires réalisés au centre des plans d’eau permettent généralement de détecter un nombre restreint d’espèces, aussi détectables en rive. Les prélèvements d’eau en zone profonde (zone centrale du lac, eau prélevée à « fond – 2 m » environ) ont pu donner un signal complémentaire de celui obtenu pour les rives, notamment pour des espèces pélagiques peu fréquentes dans la colonne d’eau (ex. : le corégone, Coregonus lavaretus, à Serre-Ponçon). Néanmoins, dès que ces mêmes espèces sont abondantes au sein des plans d’eau, elles sont aussi détectées en rive.

Les résultats du métabarcoding (notamment les proportions relatives des espèces inventoriées) varient au cours de l’année en fonction de l’activité des espèces. Les périodes hivernales généralement associées avec une baisse de l’activité des ectothermes³ ne sont clairement pas les plus favorables pour détecter un maximum d’espèces lacustres. Seules des espèces psychrophiles⁴ et pélagiques peuvent être plus détectées l’hiver, notamment quand elles se rapprochent des berges. Pour la majorité des autres espèces, les pics de détection se situent au printemps au moment de la reproduction (notamment en lien avec l’augmentation des quantités d’ADN dans l’eau via les gamètes) et au début d’automne.

Concernant l’effort d’échantillonnage, deux stratégies ont été proposées au cours du projet readFish, pour tenir compte de la taille des plans d’eau et du temps de mise en œuvre sur le terrain (Hervé, 2023). Les objectifs étaient de disposer d’un échantillonnage des habitats littoraux le plus exhaustif possible, tout en limitant le temps et donc les coûts inhérents au travail de terrain. Pour les plans d’eau de moins de 1 000 ha, le périmètre a été divisé en linéaires de tailles égales, l’effort variant de un à quatre linéaires pour lesquels un échantillon intégré (30 L) a été réalisé (figure 8). Pour les plans d’eau de plus de 1 000 ha, ce dispositif n’était pas envisageable. Il n’est pas possible de trouver des combinaisons de vitesse de navigation et de vitesse de filtration qui permettent de réaliser un seul échantillon pour des périmètres aussi importants. Les grands plans d’eau ont eux été échantillonnés en constituant des linéaires d’environ 5 km le long desquels un échantillon intégré (30 L) est réalisé.

Sur les huit plans d’eau de moins de 1 000 ha intégrés au projet, deux échantillons (linéaires) est un compromis satisfaisant pour avoir une bonne estimation de la diversité piscicole. L’augmentation de l’effort n’amène pas des détections supplémentaires systématiques. Quel que soit l’effort d’échantillonnage, les espèces les plus abondantes sont toujours détectées (ex. : la perche et le gardon). Les différences de détection entre efforts d’échantillonnage (nombre de linéaires) sont dues aux espèces rares à très rares. Selon les plans d’eau, le maximum de diversité a pu être détecté avec deux ou trois linéaires.

Concernant les trois grands plans d’eau de l’étude, des disparités spatiales dans la détection des espèces ont été observées entre les linéaires. Aucun linéaire n’a permis de détecter l’ensemble des espèces présentes, même les linéaires les plus aval, proches des barrages ou de l’exutoire. Globalement il faut entre sept et huit linéaires pour détecter la plus grande majorité des espèces (soit quasiment le tour complet). Dès six linéaires, le nombre moyen d’espèces détectées dépasse le nombre d’espèces capturées par les filets maillants (en cumulées sur toutes les campagnes de pêches disponibles au moment du projet ; figure 8). Pour ces derniers, avec soixante filets on atteint difficilement une asymptote, relativement éloignée du nombre d’espèces détectées en ADNe. En plus de la capacité de détection des espèces, la différence de temps de travail sur le terrain entre les deux méthodes est remarquable : un échantillonnage ADNe est réalisée entre un jour et demi et 2 jours (à trois personnes) contre une semaine pour les campagnes au filet (à plus de trois personnes).

Le projet readFish a confirmé l’intérêt de la méthode intégratrice d’échantillonnage ADNe pour la surveillance des communautés piscicoles lacustres. Le nombre d’espèces détectées par rapport à l’effort d’échantillonnage est incomparable par rapport à la méthode traditionnelle actuellement utilisée. Les inconvénients de la méthode intégratrice restent l’absence de spatialisation du signal (juste une spatialisation à très gros grain) et la limite sur la quantification précise de l’abondance (effectif, biomasse) des différentes espèces (contrairement aux filets). Les problèmes de résolution taxonomique sont eux essentiellement liés au choix du barcode (ici, teleo).

Aller plus loin dans la valeur quantitative des données de métabarcoding

S’inscrivant en complémentarité des avancées illustrées précédemment, un projet récent (projet Quanti-Inventory) a permis d’apporter une validation méthodologique supplémentaire pour améliorer la dimension quantitative des résultats de métabarcoding. En appliquant deux stratégies d’échantillonnage (échantillonages discrets et intégrés), il s’est agi plus spécifiquement d’évaluer deux protocoles moléculaires visant à générer des données quantitatives consolidées à partir des résultats obtenus par métabarcoding. Ces protocoles moléculaires permettant le passage d’inventaires d’espèces, semi-quantitatifs (obtenus par metabarcoding), à des données quantitatives (nombre de copies d’ADN) estimées pour chaque espèce inventoriée.

Les deux méthodes testées pour obtenir une version ‘quantitative’ des données de métabarcoding sont (i) inclure des standards internes (quantités connues d’ADN venant d’espèces « exotiques ») dans chaque extrait d’ADN avant le séquençage (Ushio et al., 2018) ; (ii) combiner métabarcoding et quantification de l’ADNe de tous les poissons par dPCR (amorces généralistes ciblant les poissons) (Pont et al., 2023) (figure 2).

Les résultats obtenus par ces deux approches ont été confrontés à des données « de références » indépendantes : d’une part des données moléculaires obtenues par dPCR utilisées pour des quantifications absolues d’ADNe des principales espèces piscicoles, et, d’autre part, des données issues de pêches scientifiques traditionnelles aux filets.

Les analyses montrent que ces choix méthodologiques influencent la robustesse quantitative du métabarcoding. La collecte de grands volumes d’eau de manière intégrée spatialement tend généralement à sous-estimer les concentrations d’ADNe. Cependant, lorsque cette méthode d’échantillonnage est combinée avec le protocole moléculaire utilisant l’ajout de standards internes, elle fournit des estimations plus robustes de l’abondance des espèces. Ainsi, l’étude met en évidence la possibilité d’améliorer la fiabilité quantitative des données notamment en incluant ces standards internes ; sur cette base, des recommandations opérationnelles sont proposées pour le suivi des communautés piscicoles (Bylemans et al., in prep.).

Vers le transfert opérationnel

En s’appuyant sur l’ensemble des développements méthodologiques mentionnés ci-avant, un déploiement des méthodes ADNe pour la surveillance des assemblages piscicoles lacustres est aujourd’hui engagé sur le territoire métropolitain, via le projet Fish-DNA-Watch. Ce projet vise à transférer les protocoles de terrain vers les opérateurs (Office français de la biodiversité - OFB - dans un 1er temps) pour en tester la mise en œuvre pratique. Ce transfert s’appuyant sur la formalisation de supports écrits et vidéo détaillant les procédures de terrain s’accompagne d’un retour d’expérience des opéareurs afin d’ajuster si nécessaire certains points du protocole proposé. Le projet inclut par ailleurs un volet de comparaison avec les méthodes traditionnelles (pêches DCE). Cette comparaison vise non seulement à confronter les composition et structure des assemblages piscicoles mais aussi les estimations d’indices de qualité écologique (dans un premier temps de type IIR et IIL)⁵ utilisés en France dans le cadre de la directive cadre sur l’eau (DCE) afin d’évaluer les possibles écarts de diagnostic entre méthodes ADNe et traditionnelles.

Cette étape représentant une première mise à l’échelle de ces méthodes d’inventaires non invasifs sera fondatrice pour anticiper un déploiement plus complet, assurer une bonne complémentarité avec les méthodes traditionnelles établies et accompagner l’évolution des compétences inhérentes à l’utilisation de ces méthodes, notamment pour les agents de terrain. L’intégration de méthodes complémentaires, notamment des approches observationnelles traditionnelles et de nouvelle génération couplées aux techniques moléculaires ADN, sera probablement essentielle pour générer un corpus complet et fiable d’informations écologiques en vue de l’évaluation de l’état des écosystèmes.

Remerciements

Les auteurs souhaitent remercier OLA - ANAEE-France pour l’appui en termes de prélèvements et mesures in situ en lac, et tout particulièrement le personnel mobilisé pour les suivis de la phénologie de reproduction des poissons sur le Léman. Le projet readFish a été mené en collaboration avec T. Dejean, P. Jean et A. Valentini (Spygen), T. Peroux (INRAE), J.-C. Raymond (OFB). Le projet Quanti-Fish a été mené en collaboration avec J.Guillard, C. Rautureau et Q. Godeaux (INRAE), et avec l’appui de J.-C. Hustache, P. Perney, P. Quetin, L. Gobillot. Le projet FishDNA-Watch a été mené en collaboration avec Julie Neury-Ormanni pour l’appui à la coordination du déploiement national et aux ingénieurs et techniciens des directions régionales de l’OFB, et grâce à l’appui technique de A. Aubin (INRAE). Nous les remercions pour leur soutien à la réalisation de ces recherches.

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Photo d’entête : © Image créée à l’aide d’une application IA